Les modes d'ionisation en MS
1) MALDI
L'ionisation MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation) est un mode privilégié pour l'analyse de biomolécules. Il est relativement énergétique et préserve rarement les interactions non covalentes.
La solution d'analytes est mélangée à une solution de matrice, petite molécule organique capable de cristalliser en emprisonnant avec elle les analytes. L'échantillon introduit dans le spectromètre de masse est alors un dépôt sous forme solide : le MALDI est un mode d'analyse de surface.
La matrice est choisie en fonction de la classe moléculaire ciblée par l'analyse et de facteurs comme la solubilité respective des deux partenaires et le pH de travail.
Exemples de matrices utilisées:
2,5-DHB
HCCA
DCTB
Dans le spectromètre de masse, l'échantillon est irradié par un faisceau laser, à une longueur d'onde absorbée par la matrice (laser UV). En se désexcitant, la matrice est désorbée et passe en phase gazeuse, entraînant avec elle les molécules d'analyte. Des échanges complexes aboutissent à l'ionisation des analytes.
Avantages
- Le MALDI consomme peu d'échantillon, et chaque dépôt peut être analysé plusieurs fois. C'est une technologie adaptée aux faibles quantités d'échantillon souvent obtenues en biologie. De nombreux échantillons peuvent être déposés sur une même plaque, permettant des analyses à moyen débit.
- Le MALDI est une technologie robuste, générant peu d'encrassement et pas d'effet mémoire. Elle est relativement tolérante aux tampons biologiques (sels ou certains détergents en concentrations maîtrisées, solvants organiques). Analyser séquentiellement des molécules très différentes ou dans des solvants très différents est aisé.
- La préparation d'échantillons et l'utilisation de spectromètre de masse MALDI sont très accessibles. De même, une interprétation de premier niveau des spectres MALDI est à la portée de l'utilisateur non spécialiste.
Applications
- Composés de haute masse moléculaire (protéines entières, bio conjugués, polymère,...)
- Composés peu solubles
- Screening à moyen débit
- Cartographie d'échantillons
- Polymères
- Lipides (polaires)
- Oligonucléotides
- Microbiologie
- Imagerie par spectrométrie de masse
2) Electrospray Ionization (ESI)
L'ionisation ESI est un mode d'ionisation dit "doux", les molécules seront détectées avec leur structure intacte dans la majorité des cas (contrairement à l'ionisation par Impact Electronique (EI) ou l'Ionisation Chimique (CI)). Cette méthode de ionisation fonctionne à pression atmosphérique en présence de solvants polaires (Méthanol, Acétonitrile, H2O).
Principe de l'ESI
1) Le solvant liquide arrive à l'extrémité de l'aiguille de nébulisation .
2) Sous l'effet d'un voltage de l'ordre de plusieurs kV, des processus de répulsions des charges accumulées à l'extrémité de l'aiguille de nébulisation vont former un cône de Taylor, aboutissant à une goutte de solvant chargée.
3) En présence d'un flux de gaz (azote) et d'une haute température, le solvant va s'évaporer.
4) Lorsque la goutte de solvant est suffisamment petite, la limite de Rayleigh est atteinte. S'ensuit une explosion Coulombienne résultant dans des gouttelettes de plus en plus petites, aboutissant à la formation des ions en phase gazeuse.
Représentation schématique du processus d'ionisation ESI (source: Electrospray Ionization Mass Spectrometry: A Technique to Access the Information beyond the Molecular Weight of the Analyte, Shibdas Banerjee and Shyamalava Mazumdar . DOI: 10.1155/2012/282574)
Avantages
- Ionisation douce, préservant dans la majorité des cas les liaisons non covalentes.
- Formation d'espèces multichargées possibles.
- Couplage avec des systèmes HPLC pour les mélanges plus complexes.
- Large gamme de molécules analysables.
desAvantages
- Très sensible à la présence de sels, détergents et de certains solvants (DMSO, DMF, Chloroforme, ...), aboutissant le plus souvent à une perte d'information lors de l'analyse par spectrométrie de masse.
- Encrassement plus important et effet mémoire (détection d'ions provenant d'analyses précédentes).
Applications
- Composés de haute masse moléculaire (protéines entières, bio conjugués, polymère,...), sous conditions d'une préparation d'échantillon appropriée
- Peptides
- Oligonucléotides
- Petites molécules polaires
3) APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization)
L'ionisation APCI est un mode d'ionisation dit "doux", mais plus énergétique que l'ESI. Les molécules peuvent être détectées avec leur structure intacte, mais dans la majorité des cas des fragments de la molécule se sont formées au cours du processus d'ionisation (de façon moindre par rapport à l'ionisation par Impact Electronique (EI) ou l'Ionisation Chimique (CI)).
l'APCI est une technique complémentaire à l'ESI, et sera adaptée pour l'analyse de molécules peu ou non polaires, de faible masse ou très volatiles. Cette méthode de ionisation fonctionne à pression atmosphérique en présence de solvants polaires (Méthanol, Acétonitrile, H2O).
Certains constructeurs fournissent des sources combinant ESI et APCI, pour faciliter les analyses d'échantillons ayant des composés avec des propriétés différentes.
Principe de l'APCI
1) Le solvant liquide arrive dans une chambre de chauffage à très haute température (400 à 500°C) en présence d'un flux de gaz (azote) parallèle, se mélangeant au moment de l'évaporation.
2) A l'aide d'un gaz de séchage (azote) les gouttelettes de solvant vont subir un processus de désolvatation.
3) Les molécules de solvants évaporées sont ionisées à l'aide d'une aiguille de décharge Corona. Cette aiguille, source constante d'électrons, qui au contact du gaz ambiant va former un plasma contenant des ions "réactifs" (H3O+, CH3OH2+, CH3CNH+, NH4+, OH-, Cl-, ...).
4) Dans le cas du mécanisme d'ionisation par transfert de protons, les ions ainsi générés vont transférer leur proton ou en capter un sur la molécule de l'échantillon, formant un ion de la molécule.
Représentation schématique du processus d'ionisation APCI (exemple du mécanisme d'ionisation par transfert de proton. Sources: 1) Interfaces for LCMS, Shimadzu company, https://www.shimadzu.fr/service-support/technical-support/analysis-basics/basics_of_lcms/interfaces_for_lcms.html, 2) Principes de la spectrométrie de masse, Marie-Claude Menet, Revue Francophone des laboratoire, décembre 2011, numéro 437)
Avantages
- Complémentaire de l'ESI.
- Couplage avec des systèmes HPLC pour les mélanges plus complexes.
- Appropriés pour l'analyse de petites molécules (< 1000 Da), peu ou non polaires, volatiles.
desAvantages
- Fragmentation des molécules d'intérêts possibles.
- Non approprié pour de l'analyse de grosses molécules ou de complexes.
Applications
- Petites molécules (< 1000 Da) peu ou non polaires
- Lipides
- Analyses de polluants
- Drogues
- Molécules ne s'ionisant pas en solution
4) APPI (Atmospheric Pressure Photo- Ionization)
L'ionisation APPI est basé sur un système proche de l'APCI, et est une ionisation douce. l'aiguille Corona est remplacée par une lampe UV à photon. Ce processus est moins énergétique que l'APCI, réduisant la fragmentation des molécules au cours de l'ionisation, avec la possibilité d'obtenir un ion moléculaire de la molécule analysée (M+°).
Ce type d'ionisation est recommandée pour l'analyse de stéroides, de composées basiques et les pesticides.
En cas de couplage LC-MS, les solvants classiques utilisés en phase inverse ne sont pas ionisés (H2O, MeOH, MeCN), car leur énergie d'ionisation est plus élevée que celle des photons émis par la lampe UV.
Principe de l'APPI
1) Le solvant liquide arrive dans une chambre de chauffage à très haute température (400 à 500°C) en présence d'un flux de gaz (azote) parallèle, se mélangeant au moment de l'évaporation.
2) A l'aide d'un gaz de séchage (azote) les gouttelettes de solvant vont subir un processus de désolvatation.
3) Les molécules sont irradiées avec des photons provenant de la lampe UV. Si l'énergie d'ionisation du photon est supérieur à celle de la molécule d'intérêt un ion radicalaire M+° peut être généré. En présence d'un solvant protique (MeOH, H2O), la molécule peut être ionisée par un transfert de proton du solvant vers la molécule.
Représentation schématique du processus d'ionisation APPI ( Sources: 1) Interfaces for LCMS, Shimadzu company, https://www.shimadzu.fr/service-support/technical-support/analysis-basics/basics_of_lcms/interfaces_for_lcms.html, 2) Principe et applications de la source sous Photoionisation à Pression Atmosphérique (APPI) pour le couplage de la chromatographie en phase liquide à la spectrométrie de masse (LC-APPI/MS), Patrick Arpino, Spectra Analyse, numéro 267)
Avantages
- Complémentaire de l'ESI et l'APCI.
- Couplage avec des systèmes HPLC pour les mélanges plus complexes.
- Absence de bruit de fond dû à certains solvants de HPLC (H2O, MeOH, MeCN).
- Faible fragmentation des molécules.
desAvantages
- Non approprié pour de l'analyse de grosses molécules ou de complexes.
- l'ionisation est dépendante de la valeur d'énergie d'ionisation: des molécules d'intérêts, des photons et d'éventuels dopants. Cette méthode d'ionisation demande plus d'optimisation des conditions de préparation d'échantillons, d'analyses ou instrumentales.
Applications
- Petites molécules (< 1000 Da) peu ou non polaires
- Pesticides
- Molécules basiques
- Stéroïdes
- Molécules ne s'ionisant pas en solution